花生紅衣作為花生生產(chǎn)過程中價值極低的副產(chǎn)物，除了用于動物飼料外，大部分被當作廢棄物而造成資源浪費。近些年研究發(fā)現(xiàn)，花生紅衣中富含多酚類物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)和利用價值。花生紅衣中多酚類物質(zhì)含量為90~125mg/g，包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等物質(zhì)，其中原花青素占花生紅衣總質(zhì)量的17%，約有50%為生物活性較高的低聚體。原花青素具有較強的抗氧化能力，可作為防癌、防治心血管疾病藥物的主要有效成分，可用作安全無毒的新型天然抗氧化劑。目前，市場上原花青素產(chǎn)品大部分是葡萄籽來源的原花青素，葡萄籽中只含有B型原花青素，其聚合度較高，平均聚合度可達14.3。近年來研究較多的花生紅衣富含A型原花青素，聚合度較低，平均聚合度為3.2。研究發(fā)現(xiàn)只有低聚體原花青素(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收，A型與B型原花青素在人體內(nèi)發(fā)揮的作用不同。鑒于花生紅衣與葡萄籽來源的原花青素不同，有待于開發(fā)花生紅衣來源的原花青素產(chǎn)品。
不同純度的原花青素在食品、保健品、藥品以及化妝品等領域有一定的應用，市場對其純度的需求也不同。目前分離純化方法主要有溶劑萃取法、層析法、液相制備色譜等，但大孔樹脂法應用最為廣泛，其設備簡單、操作方便、便于工業(yè)化生產(chǎn)。本文采用大孔吸附樹脂對花生紅衣原花青素進行分離純化，并用HPLC-MS對純化產(chǎn)物進行分析鑒定。
花生紅衣原花青素的提取
用小型高速粉碎機將花生紅衣粉碎至過40目篩，每千克花生紅衣采用10L石油醚去除脂類物質(zhì)，于30℃恒溫水浴鍋中脫脂5h，抽濾，濾渣置于通風櫥中去除石油醚，保存在干燥器中備用。每千克脫脂花生紅衣采用10L體積分數(shù)為70%的乙醇溶液提取，在超聲功率120W、超聲溫度35℃的條件下，超聲提取10min，相同條件下提取3次。合并過濾得到的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到花生紅衣原花青素粗提物。
大孔吸附樹脂純化花生紅衣原花青素
大孔吸附樹脂的預處理
大孔吸附樹脂常含有一些單體、分散劑和致孔劑等，使用時需要除去這些有毒的有機殘留物，所以必須經(jīng)過預處理。預處理方法：無水乙醇浸泡24h→用無水乙醇洗至流出液與水1∶5不渾濁→用去離子水洗至無醇味→5%HCl溶液浸泡2～4h→用去離子水洗至流出液為中性→2%NaOH溶液浸泡2～4h→去離子水洗至流出液為中性，備用。
大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸試驗
將經(jīng)預處理后的大孔吸附樹脂抽濾并吸干其表面水分，準確稱取4種預處理后的樹脂1g分別置于25mL具塞錐形瓶中，各加入10mL(質(zhì)量濃度為5.02mg/mL)花生紅衣原花青素粗提液，搖勻，放入氣浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為120r/min，溫度為30℃。在0.5、1、2、3、4、5、6、12、18、24h時吸取上清液，測定上清液中原花青素的含量，并以吸附量對時間作圖，得到各樹脂的吸附動力學曲線。過濾吸附飽和的樹脂，分別加入20mL95%乙醇，在氣浴恒溫振蕩器中振蕩24h，過濾解吸液，測定其中原花青素含量。按下式計算吸附率、吸附量和解吸率。
(1)吸附率=(C0-C1)/C0×100%
(2)吸附量=(C0-C1)×V1/m
(3)解吸率=C2×V2/(C0-C1)×V1×100%
式中：C0為花生紅衣原花青素粗提液質(zhì)量濃度，mg/mL;C1為經(jīng)樹脂吸附后上清液中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL;C2為原花青素解吸液質(zhì)量濃度，mg/mL;V1為經(jīng)樹脂吸附后上清液體積，mL;V2為原花青素解吸液體積，mL;m為干樹脂質(zhì)量，g。
大孔樹脂AB-8純化花生紅衣原花青素
稱取已處理的AB-8大孔吸附樹脂裝填入層析柱，將一定質(zhì)量濃度的花生紅衣原花青素粗提液(以澄清為好)上柱，柱溫為室溫;洗脫時首先用4BV蒸餾水洗去相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì);然后用4BV不同體積分數(shù)的乙醇溶液將吸附在樹脂上的原花青素梯度洗脫下來，分批收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到原花青素純化物。接下式計算產(chǎn)物原花青素的純度和回收率。
(4)純度=純化物中原花青素質(zhì)量/純化物質(zhì)量×100%
(5)回收率=洗脫液體積×洗脫液中原花青素質(zhì)量濃度/(上樣液體積×上樣液中原花青素質(zhì)量濃度)×100%
原花青素的測定
原花青素標準曲線的繪制
準確稱取0.0500g原花青素標準品，加甲醇溶解并定容至25mL，得到2.0mg/mL的原花青素標準溶液(現(xiàn)配)。分別精確量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mL原花青素標準溶液于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，此時得到質(zhì)量濃度分別為0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mg/mL的工作溶液。再各取1mL工作溶液于10mL試管中，分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，搖勻，在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min，取出，在500nm波長下測定其吸光度，繪制標準曲線。回歸方程為Y=1.3306X+0.0664，R2=0.9966。
花生紅衣原花青素的測定
取1mL稀釋了一定倍數(shù)的花生紅衣原花青素粗提液，分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液，3mL濃鹽酸，搖勻，在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min，取出，在500nm波長下測定其吸光度，由標準曲線回歸方程可計算樣品中原花青素的質(zhì)量濃度。
1.2.4HPLC-MS測定花生紅衣原花青素
將洗脫級分10mg分別溶于10mL色譜純甲醇中，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進行HPLC-MS分析。
色譜條件：色譜柱為CSH柱(2.1mm×100mm，粒徑1.9μm);流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液;柱溫45℃;進樣量1μL;流動相洗脫條件為0~0.1min，5%A;0.1~30min，5%~20%A;30~32min，20%~80%A;32~32.5min，80%~5%A;32.5~35min，5%A。
質(zhì)譜條件：ESI電離源，負離子模式;毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓40.0V;離子源溫度100℃，脫溶劑溫度400℃;錐孔氣流速50.0L/h，脫溶劑氣流速700.0L/h;碰撞電壓6V;相對分子質(zhì)量掃描范圍(m/z)50~2000。
2結果與討論
2.14種大孔吸附樹脂對花生紅衣原花青素的靜態(tài)吸附率和解吸率
大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩原理相結合的分離介質(zhì)，其吸附力與吸附樹脂和吸附質(zhì)之間的范德華力和氫鍵作用有關。本試驗所用大孔吸附樹脂包括極性樹脂(NKA-9)、中極性樹脂(HPD750)、弱極性樹脂(AB-8)和非極性樹脂(D101)：
NKA-9和AB-8大孔吸附樹脂對原花青素均有較大的吸附率，D101大孔吸附樹脂的吸附率低于其他大孔吸附樹脂。原花青素分子中含有多個酚羥基，可形成氫鍵，具有一定的親水性和極性，容易被極性、中極性和弱極性樹脂吸附。除此之外，大孔吸附樹脂的吸附能力還與其孔隙結構、比表面積等有關。HPD750比表面積大，孔徑小，不利于原花青素分子通過樹脂的孔徑擴散到其內(nèi)表面而被吸附。NKA-9表面極性大，對原花青素分子產(chǎn)生強烈吸附，會阻礙原花青素的解吸。大孔吸附樹脂的靜態(tài)動力學曲線一般可以分為兩種類型：第1種是快速平衡型，其特征是在吸附的起始階段吸附量迅速增加，很快達到吸附平衡;第2種是慢速平衡型，起始階段吸附量較小，吸附量的上升速度緩慢，吸附平衡時間較長。AB-8、NKA-9、D101樹脂對原花青素的吸附屬于快速平衡型，而HPD750則屬于慢速平衡型。因此，綜合考慮樹脂吸附量、解吸率以及靜態(tài)吸附動力學特征發(fā)現(xiàn)，AB-8大孔樹脂吸附量大、解吸容易并可以較快達到吸附平衡，故選用AB-8大孔吸附樹脂作為分離純化花生紅衣原花青素的吸附材料。
上樣流速對AB-8大孔吸附樹脂吸附原花青素的影響
上樣流速小，樣液中溶質(zhì)與樹脂接觸時間長，其吸附較為完全;流速過大，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂的內(nèi)表面進行吸附，導致吸附不充分，且浪費了樣品。因此，本試驗研究上樣流速對AB-8大孔吸附樹脂吸附原花青素的影響：
上樣流速為0.25mL/min和0.5mL/min時，大孔樹脂對原花青素的吸附率比較高，泄漏時間分別出現(xiàn)在250min和180min。當上樣流速為0.75mL/min和1.0mL/min時，泄漏時間出現(xiàn)較早，吸附過程不完全。考慮到實際的生產(chǎn)情況，選取0.5mL/min上樣流速較為合適。
洗脫流速對原花青素洗脫效果的影響
為了使洗脫液與AB-8大孔吸附樹脂所吸附的溶質(zhì)有充分的接觸時間，進行有效地解吸，必須使洗脫液以合適的流速進行洗脫，因此考察了洗脫流速對原花青素洗脫效果的影響：
洗脫流速為0.5mL/min和1.0mL/min時，洗脫效果相差不大，而當洗脫流速達到2.0mL/min以上時，洗脫效果明顯變差，原花青素純度也呈下降趨勢。因此，選擇洗脫流速為1.0mL/min，此時原花青素的解吸率為89.31%，純度為98.7%。
不同體積分數(shù)乙醇對原花青素的洗脫效果
大孔吸附樹脂進行分離純化時常用的洗脫劑為乙醇溶液，不同體積分數(shù)乙醇溶液的極性不同，其對原花青素的洗脫能力也有所差異，因此本試驗研究了不同體積分數(shù)乙醇溶液對原花青素的洗脫效果的影響：
乙醇體積分數(shù)對花生紅衣原花青素的洗脫曲線有很大的影響，其中40%乙醇溶液的洗脫曲線峰值最高，在0.8～2.5BV范圍內(nèi)收集到的原花青素質(zhì)量濃度相對較高。20%乙醇溶液對原花青素的洗脫效果較好，洗脫曲線有明顯的峰值，稍有拖尾現(xiàn)象。10%和95%乙醇溶液對原花青素洗脫能力差，洗脫曲線無明顯峰值。因此，可以通過收集不同范圍內(nèi)的洗脫液來制備不同純度的原花青素。
洗脫方式或收集方式對原花青素解吸效果的影響
原花青素是由不同聚合度的兒茶素或表兒茶素組成的混合物，含有大量的酚羥基，樹脂吸附過程中極有可能發(fā)生氫鍵吸附，則不同聚合度的原花青素被吸附和解吸的過程和速度必然存在差異。因此，梯度洗脫極有可能獲得聚合度不同或純度不同的原花青素。列出不同體積分數(shù)乙醇洗脫收集到4種原花青素的解吸效果：
采用20%乙醇溶液進行洗脫得到的原花青素的純度最高，采用40%乙醇溶液進行洗脫，原花青素的回收率******。因此，選擇20%和40%乙醇作為制備原花青素的洗脫劑。
另將20%和40%乙醇的洗脫液分別收集：
20%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少，純度從低到高再到低，在約2～3.5BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高，占總干重的23.4%;40%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少，純度從高到低，在約0~2BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高，占總干重的84.2%。
在工業(yè)生產(chǎn)中可根據(jù)產(chǎn)品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。當用20%乙醇進行洗脫時，收集2~3.5BV洗脫液可得到純度大于98%的原花青素，收集0~4BV洗脫液時可得到純度大于95%的原花青素;當用40%乙醇洗脫時，收集0~2BV洗脫液可得到純度85%~90%的原花青素，收集0~4BV洗脫液可得到純度約為80%的原花青素。
6HPLC-MS對花生紅衣原花青素純化物的分析結果
經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素，20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體，40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。研究發(fā)現(xiàn)只有低相對分子質(zhì)量低聚體(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收。因此，試驗所制備的花生紅衣原花青素因其相對分子質(zhì)量小，易于被人體吸收，在人體內(nèi)可充分發(fā)揮其生理功能。
3結論
研究了AB-8大孔吸附樹脂分離純化得到不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝。******分離純化條件為：上樣流速0.5mL/min，洗脫流速1.0mL/min，洗脫液20%和40%乙醇溶液。解吸后得到20%乙醇純化物和40%乙醇純化物，20%乙醇純化物純度最高，可達98.7%，回收率較低，為29.41%，40%乙醇純化物純度為86.2%，回收率較高，為5031%。通過不同的收集方式可得到不同純度的原花青素，因此在工業(yè)生產(chǎn)中可根據(jù)產(chǎn)品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。
由HPLC-MS分析可知，經(jīng)AB-8大孔樹脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素，20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體，40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。